Die Grundlage der "Bibliotheca Electoralis" legte um 1500 mit seiner Sammeltätigkeit der sächsische Kurfürst Friedrich der Weise, der zu den zentralen Herrscherpersönlichkeiten des spätmittelalterlichen Reiches zählte und von seiner Wittenberger Residenz aus enge Kontakte zu führenden Gelehrten in ganz Europa unterhielt. Mit der Aufsicht über seine in ihren Anfängen wohl vorrangig auf höfische Repräsentation ausgelegte Bibliothek beauftragte der Kurfürst 1512 seinen Rat und Hofhistoriografen Georg Spalatin (1484-1545), der als gelehrter Humanist selber zum Kreis der Wittenberger Reformatoren um Luther und Melanchthon gehörte. Spalatin gelang es, die Bibliothek zum zentralen Wissensspeicher der Wittenberger Reformatoren auszubauen. Auch unter den Nachfolgern Friedrichs des Weisen, den Kurfürsten Johann dem Beständigen (1468-1532) und Johann Friedrich dem Großmütigen (1503-1554), nahm Spalatin diese Aufgabe wahr.
In der "Bibliotheca Electoralis" spiegeln sich nicht nur die geistesgeschichtlichen Strömungen des Humanismus wider, sondern auch die vielschichtigen politischen Entwicklungen auf Reichs-, territorialer und dynastischer Ebene. So bedeutete die militärische Niederlage der im Schmalkaldischen Bund unter kursächsischer Führung zusammengeschlossenen Fürstenopposition in der Schlacht von Mühlberg (1547) für die Ernestiner nicht nur den Verlust von Kurwürde und dazu gehörigem Territorialbesitz, sondern markiert auch das Ende der "Bibliotheca electoralis" in Wittenberg. Gemäß Wittenberger Kapitulation behielten Johann Friedrich und seine Erben ihre thüringischen Gebiete sowie bewegliche Güter, wozu auch die über 1.500 Bände zählende Bibliothek einschließlich ihrer Handschriften und Inkunabeln zählte.
In Kisten und Fässern verpackt gelangte der Bestand zunächst nach Weimar in die Residenz der Ernestiner. Im August 1549 wurde sie dann nach längeren brieflichen Verhandlungen zwischen Johann Friedrich und seinen Söhnen und Räten in das Dominikanerkloster St. Pauli nach Jena transportiert. In den Auseinandersetzungen um die Verteidigung des orthodoxen Luthertums und im Zusammenhang mit der Jenaer Universitätsgenese ab 1548 wuchs der "Bibliotheca electoralis" bald nach ihrer Ankunft ihre wichtige Rolle als geistiges Zentrum und identitätsstiftender Faktor zu. Fortan diente sie den Studierenden und Professoren der 1557/58 zur Universität erhobenen Hohen Schule als Arbeitsbibliothek.