1512 gibt Friedrich der Weise brieflich Auskunft über seine Beweggründe und schreibt, dass er die Einrichtung einer Bibliothek in seiner Wittenberger Residenz plane, und zwar zum allgemeinen Nutzen aller, der Lehrer wie der Schüler der Wittenberger Universität; denn mit Gottes Hilfe habe er eine Hochschule einrichten lassen und wolle nun die Studierenden auch durch die Anschaffung von Büchern fördern. Adressat dieses Briefes war der berühmte Verleger Aldus Manutius (1450-1515), aus dessen venezianischer Offizin der Kurfürst zahlreiche Texte klassischer - vor allem griechischer - Autoren bezog. Manutius, den der Kurfürst als Retter der antiken Autoren lobte, galt als gelehrter Humanist, er war Schöpfer einer neuen griechischen Drucktype und mit seinem Verlagsprogramm Schnittstelle bei der Verbreitung humanistischen Wissens in Europa.
Neben persönlichen Kontakten bediente sich der Kurfürst seiner Agenten, um den italienischen Buchmarkt beobachten zu lassen und den Ausbau seiner Sammlung auf hohem Niveau und vor allem gezielt voranzutreiben. Lieferungen erhielten der Kurfürst und auch seine Nachfolger aus den führenden Offizinen aus dem Süden und Südwesten des Reichs, aber auch aus Italien, besonders aus Venedig, sowie aus Lyon und Paris. Mit dem weiteren Fortschreiten der Reformation gelangte zudem Säkularisationsgut aufgehobener sächsisch-thüringischer Klöster in die Wittenberger Bibliothek, darunter auch zahlreiche mittelalterliche Handschriften, die heute zu den wertvollsten Stücken der ThULB zählen. Erst später, nach der Ankunft der "Bibliotheca electoralis" in Jena von Erfolg gekrönt war der Erwerb der Büchersammlung von Georg Rörer , einem engen Vertrauten Luthers und dessen Sekretär. Mit dieser Sammlung gingen nicht nur zwei Bibel-Handexemplare Luthers mit zahlreichen Randnotizen des Reformators in den Jenaer Bestand über, sondern auch zahlreiche Mitschriften Rörers von Luthers Predigten, Tischreden, Vorlesungen, Disputationen etc. Im planvollen Erwerb der Rörer-Sammlung zeigt sich einmal mehr die Bedeutung der Bibliothek in der akademischen Frühphase der Jenaer Universitätsgründung.
In Wittenberg korrelieren die Zuwachsraten der Bibliothek mit der Einführung neuer Statuten an der dortigen Universität 1534; für jenes Jahr wird erstmals ein jährlicher Erwerbungsetat fassbar. Durch die Neuaufstellung der Bibliothek an einem "bequemen ort in unsern schlos zu Wittenberg als in der großen Hofstube" (Schreiben Johann Friedrichs) entsteht eine frühe Form der "Studienbibliothek" : Die Bücher werden an Pulte gekettet und in Katalogen erschlossen, um das Wissen für einen erweiterten Kreis von Nutzern zugänglich zu machen, aber auch um die wertvollen Bestände vor Entfremdung zu schützen. Auch wenn die Bibliothek noch lange nicht zu dem wurde, was man mit der Gebrauchsbibliothek seit der Aufklärung assoziiert, so hatte sie sich bereits in Wittenberg doch ganz deutlich in Richtung einer Arbeitsbibliothek für Professoren und Studierende entwickelt.